Обитель берет своё начало с 1528, с момента прихода Преподобного Нила на остров Столобный, что на озере Селигер.
Через несколько лет, после представления Преподобного Нила Столобенского, в 1594 году, дается Благословение, на открытие монастыря Нилова пустынь.
В 18-19 веках, монастырь Нилова пустынь был одним из крупнейших культурных центров России, с огромнейшей библиотекой, образовательными заведениями, со своим большим производством товаров и продуктов.
Именно в Ниловой пустыне учился Леонтий Магнитский, математик и педагог, у которого, в последствии, учился Великий Ломоносов. Нилову пустынь посещали множество великих людей, в том числе, Император Александр I и Президент России Владимир Путин.
После кощунственного разграбления и частичного разрушения монастыря большевиками, корпуса используются как колония для несовершеннолетних, как лагерь для военнопленных, как военный госпиталь, как турбазу. Когда все здания монастыря пришли в негодность и не могли больше использоваться, без капитального ремонта, Советом Министров РСФСР, в 1990 году, комплекс монастыря был передан Московской Патриархии РПЦ.
В 2016 году исполняется 25 лет со дня возрождения Нило-Столобенского монастыря. Впереди, предстоят ещё колоссальные работы, чтобы возвратить бывшее благолепие святой обители. Но уже сейчас, Нило-Столобенская пустынь является жемчужиной Тверской епархии. Даже невзирая на все разрушения, постигшие от безбожной власти, эта обитель при всем этом предстоит пред нами во всей своей красе и величии гения зодчества, благочестивых предков земли Русской.
Сегодня, монастырь, благодаря наместнику архимандриту Аркадию (Губанову), успешно восстанавливается братией и уже имеет своё автономное производство продуктов, которое пользуется большим спросом у паломников и местных жителей.
